הכנה למבחן כימות חלבונים

1. שיטת Gating strategy ב־flow cytometry מאפשרת לנגד אונוכלוסיות האם על סמך ביטוי של גנים ספציפיים. ✅ נכון → ב־flow cytometry משתמשים ב־gating כדי לסנן ולזהות תאים מסוימים על סמך סמנים ספציפיים (כמו חלבונים על הממברנה או בתא, לרוב זוהרים), וזה מאפשר הפרדה בין אוכלוסיות תאים שונות. 2. מבחן ELISpot מודד את רמות החלבון בגודל בלבד, ללא התייחסות לתא שהפריש אותו. ❌ לא נכון → ELISpot הוא מבחן שמודד הפרשה של חלבונים ברמת התא הבודד, למשל ציטוקינים. רואים נקודה בכל מקום שתא הפריש בו את החלבון – ולכן הוא כן מתייחס לתא שהפריש. לא מודד "גודל" של חלבון. 3. בשיטת FluoroSpot ניתן לזהות בו זמנית האם שמפרישים שני ציטוקינים שונים בעזרת פלואורופורים שונים. ✅ נכון → FluoroSpot היא גרסה מתקדמת של ELISpot שבה משתמשים בפלואורופורים שונים לזיהוי הפרשת שני חלבונים שונים מתא אחד, וכך ניתן ללמוד על תאים רב-תכליתיים. 4. היסטולוגיה רגילה מאפשרת לוקליזציה של חלבון בתוך הרקמה אך מוגבלת לזיהוי של חלבון אחד בלבד. ❌ לא נכון → ניתן לזהות יותר מחלבון אחד – באמצעות צביעות אימונוהיסטוכימיות שונות, ואפילו שילוב של נוגדנים עם סמנים פלואורסצנטיים. אין מגבלה עקרונית לחלבון אחד בלבד. 5. בשיטת Light Sheet Microscopy, הרקמה נחתכת לפרוסות דקות כדי לאפשר חדירה של קרני לייזר. ❌ לא נכון → Light Sheet מאפשר הדמיה תלת־ממדית שלמה של דגימות שלמות (ולאו דווקא חתוכות) עם חדירה ממוקדת של קרן אור (sheet). אחת מיתרונותיה היא שניתן לבדוק דגימות שלמות מבלי לחתוך לפרוסות דקות. 6. Cryo-imaging של עכבר שלם דורש הקפאה וחתכים שלמים בסדרות עקביות של פרוסות רקמה. ✅ נכון → Cryo-imaging אכן מבוססת על הקפאת הדגימה ואז חיתוך מדורג לפרוסות, עם צילום של כל פרוסה, כדי לייצר תמונה תלת־ממדית ברזולוציה גבוהה. 7. בשיטת FLI (Fluorescence Imaging) ניתן לדחות חלבונים בעכברים חיים, בתנאי שהחלבון שקוף או חסר שייר שומן. ✅ נכון חלקית – סומנה כנכונה → FLI אכן משמש להדמיה של חלבונים בתאים או בעכברים חיים, אך תנאי ההדמיה תלויים באם החלבון סומן בפלואורופור ולאו דווקא אם הוא שקוף או חסר שייר שומן. לא ניסוח מדויק – אבל כנראה התקבל. 8. שיטת Salting Out מצליחה את העדות של חלבונים מסיסים יותר בריכוזים גבוהים של מלחים. ✅ נכון → Salting Out היא שיטה להפרדת חלבונים לפי המסיסות שלהם – חלבונים פחות מסיסים שוקעים ראשונים בריכוזי מלח גבוהים. לכן זה אכן תהליך מבוסס על שקיעת חלבונים לפי ריכוז מלח.

הרחבה: ProQuantum משתמש בטכנולוגיית qPCR לזיהוי חלבונים, מה שמאפשר זיהוי כמויות מאוד קטנות של חלבון (רגישות גבוהה מאוד). הוא מתבסס על זיהוי של קומפלקס נוגדן-אנטיגן ויוצר תוצר DNA קטן, שאותו אפשר להכפיל ולמדוד ב-qPCR. העובדה שאין צורך בשטיפות (כמו באלייזה) מפחיתה רקע לא ספציפי, וכך משפרת את אות לרעש.

מקורות נפוצים לפעילות HRP אנדוגנית: תאים שמכילים פרוקסידאזות טבעיות, כמו לויקוציטים (נויטרופילים, מקרופאגים). רקמות כמו כבד, טחול, כליה, מח עצם – המכילות אנזימים פרוקסידאזיים. למה זה חשוב? HRP משמש באנליזות רבות (כמו Western blot, אימונוהיסטוכימיה - IHC, ELISA ועוד) כ"סמן" שמחובר לנוגדן שניוני ומספק איתות בעזרת תגובה כימית בצבע או באור. אם ברקמה יש פעילות HRP אנדוגנית, היא יכולה: לגרום לרקע גבוה. ליצור false positives (תוצאה שנראית כאילו הנוגדן זיהה אנטיגן, למרות שזה רק פעילות אנזימטית טבעית של התא).

הסבר: בווסטרן בלוט (Western Blot) השלב הראשון הוא הפרדת חלבונים לפי גודל באמצעות SDS-PAGE, ואחר כך מועברים החלבונים לממברנה, שם ניתן לזהות חלבון מסוים באופן ספציפי באמצעות נוגדן ייחודי לו. יתרון מרכזי של השיטה הוא הספציפיות הגבוהה – ניתן לזהות חלבון מסוים מתוך תערובת מורכבת מאוד של חלבונים, בתנאי שיש נוגדן איכותי נגדו. פירוט שגוי של שאר התשובות: קבלת מסה מדויקת – SDS-PAGE מאפשר הערכה של גודל חלבון, אך לא מדויק כמו ספקטרומטר מסה. קבלת אינטראקציות עם חלבונים אחרים בזמן אמת – זה לא תפקיד של Western Blot, אלא שיטות כמו Co-IP או FRET. הרצת חלבון ללא השפעת מודיפיקציות – ההפך! SDS מפשט חלבונים ומבטל את ההשפעות של מבנה שלישוני ורביעוני, כולל חלק מהמודיפיקציות.

טכנולוגיית CyTOF (קיצור של Cytometry by Time Of Flight) היא שילוב בין ציטומטריה של זרימה (Flow Cytometry) לבין ספקטרומטריית מסה, והיא מאפשרת ניתוח רב-סמני של תאים בודדים. במקום להשתמש בסמנים פלואורסצנטיים (כמו ב-Flow Cytometry רגילה), CyTOF משתמשת בנוגדנים שמחוברים לאיזוטופים של מתכות נדירות, שכל אחד מהם בעל מסה שונה. לאחר מכן, התאים מעובדים ומיוננים לפי זמן תעופה (TOF = Time of Flight) בספקטרומטר מסה, שמודד את המסות של המתכות שנמצאות על כל תא. ✅ כך ניתן לזהות עשרות חלבונים שונים בתא בודד, מבלי בעיית חפיפות ספקטרליות שקיימת בפלואורסנציה. ❌ שאר התשובות – שגויות: שימוש בפלואורסנציה לזיהוי חלבונים תוך תאיים – מתאר Flow Cytometry קלאסי, לא CyTOF מיון תאים על פי גודל בלבד – לא מדויק, וגם לא ייחודי ל-CyTOF חיבור בין נוגדנים ודנ"א עם ליגאז – אין קשר ל-CyTOF; זה רלוונטי אולי ל־Proximity Ligation Assay (PLA)