הכנה למבחן כימות חלבונים

בשיטת ביוראט (Biuret assay), מתרחש שינוי צבע ל-סגול כתוצאה מ־תרומת אלקטרונים מקבוצות האמין של החלבונים ליוני נחושת (Cu²⁺) בתמיסה בסיסית. התגובות יוצרות קומפלקס סגול, והעוצמה של הצבע נמדדת בספקטרופוטומטר (לרוב ב-540–560 ננומטר), ומאפשרת כימות של ריכוז החלבון. יתר האפשרויות: ❌ ננודרופ – מודד ספיגה ישירה ב־280 ננומטר, ללא תגובה כימית או צבע. ❌ BCA – גם כן מבוסס על קומפלקס עם יוני נחושת, אבל הצבע הוא סגול-כחול/ירוק שנמדד ב־562 ננומטר, ונדרש שלב נוסף של תגובה עם חומצה ביסינכונית (BCA), לא רק תרומת אלקטרון. ❌ SDS-PAGE – שיטה להפרדת חלבונים לפי גודל, אינה שיטת כימות ישירה ואינה מבוססת על צבע סגול.

BCA (Bicinchoninic Acid Assay): זוהי שיטה קולורימטרית נפוצה ויעילה לכימות חלבונים כולל בדוגמאות מרובות חלבונים. היא מבוססת על תגובה של יוני נחושת (Cu$^{2+})עםקשריפפטידבחלבונים(תגובהביוּרֵט),ולאחרמכןתגובהשליוניהנחושתהמחוזרים(Cu^{+}$) עם חומצה ביקונינכונינית (BCA), אשר יוצרת תוצר סגול הניתן לכימות ספקטרופוטומטרית. היתרון הגדול של שיטה זו הוא שהיא אינה דורשת ידע ספציפי על רצף החלבונים בדוגמה. כימות לפי חומצות אמינו: שיטה זו אכן יכולה לספק מידע כמותי מדויק על חלבונים, אך היא דורשת הידרוליזה של החלבונים לחומצות אמינו ולאחר מכן הפרדה וכימות של חומצות האמינו. למרות שהיא אינה דורשת ריצוף "ישיר" של החלבונים, היא עדיין תהליך מורכב יותר ופחות "כללי" לכימות כולל של חלבונים בדוגמה מרובת חלבונים מבלי לדעת מראש אילו חלבונים קיימים. אלייזה בשיטת סנדוויץ' (Sandwich ELISA): שיטה זו היא ספציפית ביותר ומיועדת לזיהוי וכימות של חלבון יחיד וספציפי בתוך תערובת מורכבת. היא דורשת נוגדנים ספציפיים לחלבון המטרה ולכן אינה מתאימה לכימות כללי של "דוגמה מרובת חלבונים" ללא צורך בריצוף, אלא אם כן רוצים לכמת חלבון מסוים מאוד מתוך התערובת. היא דורשת ידע מוקדם על החלבון שאותו רוצים לכמת וזמינות של נוגדנים מתאימים.

תרגום חלבון מתוך רצף RNA, אחת הבעיות המרכזיות היא שקיימות 6 מסגרות קריאה אפשריות (3 בכיוון אחד ועוד 3 בכיוון ההפוך ב-DNA), ומתוכן רק אחת בדרך כלל מובילה ליצירת חלבון תקין. שאר המסגרות כוללות לרוב קודוני עצירה מוקדמים (stop codons), ולכן אינן מייצרות חלבון פונקציונלי. מציאת המסגרת התקינה היא אתגר חשוב בפענוח גנים.