הכנה למבחן כימות חלבונים

הסבר: ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot) מזהה תאים בודדים שמפרישים חלבונים (למשל ציטוקינים) על ידי קליטת החלבון המופרש על גבי ממברנה – כל כתם מייצג תא אחד מפריש. זוהי שיטה מאוד רגישה וכמותית לפעילות תאית. Flow Cytometry משמשת בעיקר לניתוח חלבונים תוך-תאיים או סמני פני שטח של תאים, באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים. כאשר רוצים לבדוק ציטוקינים, יש צורך לבצע תיקנון תוך תאי (permeabilization) כדי לזהות את החלבון בתוך התא, לפני שיצא ממנו. ❌ למה שאר התשובות שגויות: Flow Cytometry מזהה תאים לפי רמת DNA – לא נכון, השיטה מזהה חלבונים וסמני תא, לא DNA, אלא אם משתמשים בצביעת DNA מיוחדת (כמו PI), וזה לא רלוונטי כאן. ELISpot מזהה תאים נעים, Flow מזהה תאים קבועים – לא מדויק ואפילו הפוך לעיתים: ב-ELISpot התאים דווקא מקובעים בבארית, וב-Flow הם זורמים. אין הבדל – שתיהן שיטות מבוססות אנטיגן־נוגדן לזיהוי ציטוקינים – אמנם שתיהן משתמשות בנוגדנים, אבל ההבדל משמעותי מאוד בסוג המידע שהן מספקות: מיקום החלבון (מופרש vs תוך תאי), מספר תאים פעילים, ויכולת כימות.

FLI – Fluorescence Imaging מאפשרת זיהוי ומעקב אחרי חלבונים באורגניזם חי, באמצעות תיוג פלואורסנטי של חלבונים (למשל חלבוני GFP או שימוש בצבעים פלואורסנטיים). השיטה לא דורשת הריגת בעל החיים, וניתן לבצע מעקב חוזר לאורך זמן באותו אורגניזם. ❌ שאר האפשרויות: Cryo-imaging – דורשת הקפאה עמוקה של הרקמה, ולכן הורגת את האורגניזם. Histology – עוסקת בחתכים מיקרוסקופיים של רקמות שנלקחו מאורגניזם מת. PET-CT – משמש לדימות של תהליכים פיזיולוגיים (למשל צריכת גלוקוז), אך לא לזיהוי ישיר של חלבון ספציפי, ודורש חומר רדיואקטיבי.

Light Sheet Microscopy (או SPIM – Selective Plane Illumination Microscopy) היא שיטה אופטית מתקדמת שמאפשרת צילום תלת־ממדי של רקמות שלמות (כולל עוברי עכברים, איברים וכו') מבלי צורך לחתוך אותן לפרוסות. היא עושה זאת על ידי הארה של שכבות דקות (sheets), וכך מתקבלת תמונה תלת-ממדית עם שמירה על מבנה הרקמה – אידאלי לדימות מבנים אנטומיים וחלבונים בפיזור מרחבי. ❌ למה שאר התשובות שגויות: Light Sheet מאפשרת רזולוציה גבוהה יותר של חלבון גרעיני – לא ייחודי או עיקרון מייחד של Light Sheet. הרזולוציה לרוב פחותה ממיקרוסקופ קונפוקלי. Cryo-imaging לא מאפשר שילוב של חלבונים בצביעה כפולה – Cryo-imaging דווקא יכול לאפשר צביעות מרובות. Cryo-imaging דורש סימון עם לוציפראז בלבד – לא נכון. Cryo-imaging תומך גם בפלואורסנציה רגילה, לא רק לוציפראז.